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疏水層析實(shí)驗(yàn)(HIC)原理、實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)

 發(fā)布時(shí)間:2023/7/7 點(diǎn)擊量:1794

原理

蛋白質(zhì)表面一般有疏水與親水基團(tuán),疏水層析是利用蛋白質(zhì)表面某一部分具有疏水性,與帶有疏水性的載體在高鹽濃度時(shí)結(jié)合。在洗脫時(shí),將鹽濃度逐漸降低,因其疏水性不同而逐個(gè)地先后被洗脫而純化,可用于分離其它方法不易純化的蛋白質(zhì)。

疏水性蛋白質(zhì)溶解于水溶液中時(shí)會(huì)發(fā)生自我聚集或自身相互作用。這種自我聚集是形成多種生物學(xué)相互作用的基礎(chǔ),如蛋白質(zhì)的折疊、蛋白質(zhì)-底物間的相互作用及蛋白質(zhì),通過(guò)細(xì)胞膜的跨膜運(yùn)輸。疏水作用層析可用于分析和制備規(guī)模的蛋白質(zhì)純化。

HIC 主要利用大分子中存在的疏水性區(qū)域與層析吸附劑上的疏水性配體結(jié)合。這種相互作用發(fā)生于有利于疏水相互作用的環(huán)境,如高鹽濃度溶液。對(duì)于非極性分子,水(極性溶液)本身不是一種好的溶劑。

在這種環(huán)境下,蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生自我聚集或者形成聚集體,使其自身處于zui低的熱力學(xué)能狀態(tài)。在蛋白質(zhì)發(fā)生自我聚集以前,水分子會(huì)在其每個(gè)分子周圍形成高度有序結(jié)構(gòu)。

在極性溶液中,非極性分子(如蛋白質(zhì))的自我聚集受到環(huán)境中凈熵值增加的驅(qū)動(dòng)。在蛋白質(zhì)聚售過(guò)程中,暴露于極性溶劑的蛋白質(zhì)疏水位點(diǎn)整體表面區(qū)域減少,從而形成縮小結(jié)構(gòu)(高熵的)環(huán)境,這是一種更有利的熱力學(xué)狀態(tài)。

用途

疏水層析不具備高分辨率,但其特性與離子交換層析互補(bǔ),可用于純化難以分離的蛋白質(zhì)。

實(shí)例1:

雞蛋溶菌酶和鯨肌球蛋白的同步分離純化
采用 Pheny1 SepharoseHP 色譜柱,實(shí)現(xiàn)對(duì)雞蛋溶菌酶和鯨肌球蛋白混合。

200 操作過(guò)程:

5 倍柱體積的緩沖液 A(50mmol/L磷酸鈉, pH 7.0;2molL)衡柱子,保證穩(wěn)定。

進(jìn)樣 1.5mL 品,用4倍柱體積緩沖液 A 沖洗柱子,用 0~100% 的緩沖液 B 進(jìn)行梯度洗脫,洗脫體積大于 30 倍柱體積,收集取樣1mL。

4 倍柱體積的緩沖液 B(pH7.0,50mmoVL 緩沖)進(jìn)行洗脫。流速控制: 2mL/min,測(cè)定在 280nm 吸光度值。

材料與儀器

試劑:
10% 硫酸銨溶液、平衡緩沖液為 10 mmol/LNa2HPO4/NaH2PO4,1.0 mol/LNH2SO4pH7.4);洗脫緩沖液為 10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4pH7.4)、SDS-PAGE

材料:層析柱、色譜填料

儀器: pH計(jì)、勻質(zhì)機(jī)、離心機(jī)、蛋白純化儀

步驟

1.硫酸銨鹽析取組織勻漿 30 g 溶于 60 ml 硫酸銨溶液(10%)中,攪拌溶解 4 小時(shí),12000 g 離心 20 分鐘;取上清液,緩緩加入硫酸銨粉末并不斷攪動(dòng),使溶液達(dá)到 35% 的飽和度,常溫靜置 2 小時(shí);12000 g 離心 20 分鐘;

取上清液,繼續(xù)緩緩加入硫酸銨粉末并不斷攪動(dòng),使溶液達(dá)到 70% 的飽和度,常溫靜置 2 小時(shí)。12000 g 離心 20 分鐘,棄上清液,將沉淀溶解后進(jìn)行疏水層析。

2.疏水層析應(yīng)先用小號(hào)柱子進(jìn)行層析條件的摸索,包括層析介質(zhì)、結(jié)合和洗脫條件等。先選用 2.6 cm x 10 cm 層析柱,平衡緩沖液為 10 mmol/L Na2HPO4,/NaH2PO4,1.0 mol/LNH2SO4pH7.4);洗脫緩沖液為 10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4pH 7.4)。

選用 Phenyl Sepharose FFOctyl Sepharose FF Butyl Sepharose FF 三種疏水介質(zhì)進(jìn)行比較,梯度洗脫,流速為 0.2 ml/min。預(yù)實(shí)驗(yàn)完成,選擇純化效果相對(duì)更好Butyl Sepharose FF 介質(zhì)、7.6 cm x 10 cm 層析柱,進(jìn)行大量層析純化。

3.純度鑒定用 SDS-PAGE 鑒定純化蛋白的純度。同時(shí)應(yīng)定量測(cè)定純化產(chǎn)物的胰激肽釋放酶活性。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 35% 飽和度的硫酸銨溶液沉淀可以除去粗品中的部分雜蛋白;再通過(guò) 70% 飽和度的硫酸銨溶液沉淀后,不但可以將胰激肽釋放酶蛋白全部沉淀,同時(shí)可起到濃縮樣品的作用。實(shí)驗(yàn)采用高離子強(qiáng)度緩沖液平衡,胰激肽釋放酶吸附于疏水介質(zhì)上,然后在低離子強(qiáng)度條件下洗脫。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) Octyl Sepharose FF 吸附蛋白能力最弱,在洗脫初始階段,大部分蛋白即被洗脫下來(lái);PhenylSepharose FF 吸附蛋白能力zui強(qiáng),洗脫液離子強(qiáng)度很低的條件下大部分蛋白才被洗脫下來(lái),這兩種介質(zhì)對(duì)分離胰激肽釋放酶蛋白的效果都不明顯。

Butyl Sepharose FF 介質(zhì)疏水性適中,可以保證溫和條件下洗脫胰激肽釋放酶。SDS-PAGE 分析結(jié)果表明鹽析后經(jīng)過(guò)一步疏水層析提純,得到比活性大于 500U/mg 的胰激肽釋放酶蛋白,電泳膠銀染色顯示有分子量在 28 kDa 左右的條帶,符合預(yù)期。

注意事項(xiàng)

1、在樣品上樣于層析柱之前,必須采用高濃度鹽的緩沖液提高蛋白質(zhì)混合物(將要采用 HIC 吸附劑純化的樣品)的鹽濃度,目的在于使目標(biāo)蛋白質(zhì)能夠與吸附劑結(jié)合。

2、蛋白質(zhì)在高鹽濃度下可能發(fā)生沉淀,所以,在選擇鹽溶液之前,應(yīng)先評(píng)估蛋白質(zhì)復(fù)合物在給定鹽溶液中的溶解性。

3、緩沖液的 pH 對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)合于 HIC 吸附劑的影響并不呈一般性的趨勢(shì),但是可以影響相互作用的強(qiáng)度。選擇緩沖液的 pH,應(yīng)該確保蛋白質(zhì)和吸附劑在該環(huán)境下能夠穩(wěn)定(如避免使用過(guò)高/過(guò)低的pH 溶液)。

4、在調(diào)整蛋白質(zhì)上樣的步驟中,鹽的濃度可以為 05~20mol/L,并且可提高濃度以確保蛋白質(zhì)能夠有效結(jié)合于吸附劑。

5、蛋白質(zhì)結(jié)合于吸附劑所需要的鹽濃度在很大程度上取決于鹽種類的選擇。如部分所述鹽種類。在大多數(shù)情況下,選擇蛋白質(zhì)結(jié)合于吸附劑的適合鹽濃度需進(jìn)行相關(guān)的預(yù)實(shí)驗(yàn)。蛋白質(zhì)結(jié)合于吸附劑上之后,必須再將目標(biāo)蛋白質(zhì)洗脫,并收集層析柱柱后的流出液。多數(shù)情況下,洗脫過(guò)程用于將不需要的蛋白質(zhì)從目標(biāo)蛋白質(zhì)中分離或者去除。不需要的蛋白質(zhì)可能與吸附劑結(jié)合的不是那么緊密,因而會(huì)先干目標(biāo)蛋白質(zhì)被洗脫。

另外一些情況下,不需要的蛋白質(zhì)會(huì)與吸附劑結(jié)合更加緊密,并會(huì)在目標(biāo)蛋白質(zhì)被洗脫之后仍與吸附劑結(jié)合。這種情況通常發(fā)生在 HIC 分離蛋白質(zhì)多聚體時(shí),目標(biāo)蛋白質(zhì)多聚體與吸附劑的結(jié)合比單體與吸附劑的結(jié)合更加緊密。在洗脫步驟中,流出液組分可能含有高純度產(chǎn)品,但在其之前或之后也會(huì)含有大量的不需要的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。

常見(jiàn)問(wèn)題

1、蛋白質(zhì)在高鹽濃度下可能發(fā)生沉淀,所以,在選擇鹽溶液之前,應(yīng)先評(píng)估蛋白質(zhì)復(fù)合物在給定鹽溶液中的溶解性。

2、緩沖液的 pH 對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)合于 HIC 吸附劑的影響并不呈一般性的趨勢(shì),但是可以影響相互作用的強(qiáng)度。選擇緩沖液的 pH,應(yīng)該確保蛋白質(zhì)和吸附劑在該環(huán)境下能夠穩(wěn)定(如避免使用pH過(guò)高/過(guò)低的溶)

3、可加少量還原劑或者去污劑防止蛋白聚集。

4、蛋白低鹽洗脫后盡快換至穩(wěn)定緩沖液中。

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